박층 크로마토그래피(f)를 사용한 마이코락톤 A/B 검출의 대체 붕산

BMC 전염병 23권, 기사 번호: 495(2023) 이 기사 인용

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측정항목 세부정보

마이코박테리움 울세란스(Mycobacterium Ulcerans)는 브룰리 궤양의 원인균입니다. M. 우세란스 질병의 병리학은 질병의 병독성에 중요한 역할을 하는 미코락톤으로 알려진 강력한 마크로라이드 세포독소의 분비에 기인합니다. 마이코락톤은 형광박층 크로마토그래피(f-TLC) 기술을 사용하여 검출할 수 있는 BU 진단용 바이오마커입니다. 이 기술은 형광성 화학센서 역할을 하는 2-나프틸보론산(BA)을 사용한 마이코락톤 A/B의 화학적 유도체화에 의존합니다. 그러나 공동 추출된 인간 조직 지질로 인한 배경 간섭, 특히 방법의 주관성과 결합된 임상 샘플의 경우 BA에 대한 대안을 찾기 위한 조사가 필요합니다.

26개의 상업적으로 이용 가능한 아릴보론산이 초기에 f-TLC 실험을 사용하여 BA의 대안으로 스크리닝되었습니다. 마이코락톤 A/B와 마이코-보론산 부가물의 흡수 최대 스펙트럼을 결정하기 위해 UV-vis 측정도 수행되었으며, 이어서 마이코락톤 A/B와 가장 유망한 3가지 보론산 사이의 보로네이트 에스테르 형성의 형광 강화 능력을 조사했습니다. 산(BA15, BA18 및 BA21). 마이코락톤과 보론산 사이의 부가물 형성을 확인하기 위해 LC-MS 기술이 사용되었습니다. 또한, 6개의 중합효소 연쇄 반응(PCR)으로 확인된 BU 환자 샘플을 사용하여 BA18과 BA 사이의 비교 연구가 수행되었습니다.

세 가지 보론산(BA15, BA18 및 BA21)은 BA보다 우수한 형광 밴드 강도를 생성했습니다. 세 가지 보론산의 0.1M 용액과 10ng~90ng에 해당하는 1μL~9μL 범위의 다양한 용량의 10ng/μL 합성 마이코락톤을 사용하여 박층 크로마토그래피(TLC)에서 수행된 복합체화 연구는 myco- 가장 눈에 띄게 강렬한 형광 밴드로 나타나는 BA18 부가물. 유리 마이코락톤 A/B의 UV-vis 흡수 최대치(λmax)는 362 nm에서 관찰되었으며, 부가물 myco-BA15, myco-BA18 및 myco-BA21의 값은 272 nm, 270 nm 및 286 nm에서 나타났습니다. 각기. 마이코락톤 A/B의 지방산 측쇄에 대해 계산된 Woodward-Fieser 값 367 nm에 대해 마이코락톤 A/B에 대한 362 nm의 비교 가능한 실험적 λmax는 2개의 고리형 보로네이트가 형성되었음에도 불구하고 남쪽 면의 보로네이트만 있음을 보여줍니다. 발색단이 있는 사슬은 365nm의 조사에 의해 여기되었습니다. 형광 실험을 통해 1,3-디올을 따라 BA18을 마이코락톤 A/B에 결합하면 537 nm에서 형광 강도가 현저하게 향상되는 것으로 나타났습니다. 고분해능 질량 분석기(HR-MS)를 사용하여 myco-BA15 부가물의 형성을 확인했습니다. 마지막으로, BA18을 사용한 환자 샘플의 f-TLC 분석은 원래 BA-부가물에 비해 향상된 BA18-부가물 강도를 제공했습니다.

BU 진단을 위한 f-TLC 분석에 사용되는 BA의 대안으로 26개의 상업적으로 이용 가능한 보론산이 조사되었습니다. BA15, BA18 및 BA21 중 3개는 우수한 형광 밴드 강도 프로파일을 제공했습니다. 그들은 마이코보론산 부가물 형성 후 해석하기 더 쉬운 프로필을 제공했으며 BA18 환자의 임상 샘플을 사용한 실험에서 가장 좋은 프로필을 제공했습니다. 따라서 BA18은 BA에 대한 잠재적인 대안으로 확인되었으며 현재 BA 사용과 관련된 임상 샘플에서 동시에 추출된 인간 조직 지질의 배경 간섭 문제에 대한 솔루션을 제공할 수 있습니다.

동료 검토 보고서

인간 병원체 마이코박테리움 울세란스(MU)에 의해 생성되는 것으로 알려진 최초의 마크로라이드 세포독소인 마이코락톤(ML)은 브룰리 궤양(BU)의 원인 물질입니다[1, 2]. 이는 Mycobacterium 속에서 확인된 유일한 마크로라이드입니다[3]. 1965년에 Connor와 동료들은 M. Ulcerans가 확산성 세포독소 생산에 책임이 있다는 가설을 세웠고, 이는 이후 기니피그를 사용하여 확인되었습니다. 마이코박테리아 배양여액을 실험동물에 주입한 결과 인간 감염과 유사한 괴사가 발생하였다[4,5,6]. 의심되는 분자는 나중에 George et al.에 의해 1999년 M. Urulans 지질 추출물의 아세톤 용해성 부분으로부터 효과적으로 분리, 정제 및 특성화되었습니다. 이후 화학 구조는 mycoactone(ML)이라는 폴리케티드로 해석되었습니다[7, 8]. ML은 클로로포름/메탄올/물(90:10:1, vol/vol/vol)에서 보유 계수 값이 0.23인 밝은 노란색의 자외선 활성 지질 밴드로 박층 크로마토그래피(TLC)에서 검출되었습니다[7]. 마이코락톤의 나트륨 부가물에 해당하는 m/z 765의 두드러진 피크가 전기분무 조건 하에서 질량 분석법(MS) 분석에 의해 관찰되었습니다. ML은 코어에 12원 락톤 고리와 남쪽에 C1'~C16'으로 표시되는 C5-O 연결 다중불포화 아실 측쇄 및 다음으로 구성된 C 연결 상부 측쇄를 갖는 하이브리드 폴리케타이드 마크로라이드입니다. 탄소 원자 C12~C20. 마이코락톤의 다양한 동족체는 "남부" 사슬의 차이로 인해 발생하는 반면, 상위 "북부" 사슬은 변하지 않습니다. 추가 연구에 따르면 M. 우세란스에서 얻은 마이코락톤은 마이코락톤 A와 B로 알려진 두 가지 입체 이성질체의 3:2 조합으로 C4' C5'의 이중 결합 주위에서 자발적인 기하 이성질체로 형성됩니다(사이의 물결선으로 표시). C5' 및 C6') [9, 10] (그림 1).